(一)确定排列顺序的方法

1.标准氧化还原电位的数值表示氧化还原能力的大小，标准氧化还原电位负值越大，其还原性越强，容易被氧化；标准氧化还原电位正值越大，其氧化性越强，容易被还原。因此呼吸链中各种组分的排列顺序应当由低电位依次向高电位排列(图－4)。

图6-4　各种传递体的标准氧化还原电位

2.还原程度来确定。Chance和Williams使用分光光度法测定离体的线粒体在有氧条件下三羧酸循环反应达到平衡时，呼吸链中各种传递体的还原程度。反应达到平衡时从底物一侧到氧一侧的各种传递体的还原程度应当是递减的，底物的一侧最高，氧一侧最低，如下表中数据所示。

表6-1　有氧动态平衡时电子传递体的还原程度

传递体	NAD	FP	Cyt b	Cyt c	Cty aa3
还原型%	53	20	16	6	1

FP：黄素蛋白

这种情况好象物理学上的联通管，图6?A中，若进水量等于出水量，即流量达到平衡时，离进水口最近的水管中水位最高，离出水管最近的水管中水位最低，从进水管到出水管水位逐渐减低，若把水流视为电子流，就是上述实验中的情况。

3.使用特异的抑制剂　特异的抑制剂能阻断呼吸链中的特定环节，阻断部位的底物一侧的各种传递体应为还原型，阻断部位的氧一侧的各种传递体应为氧化型，正象我们阻断联通管的底部一样，阻断部位以前的各水管中水是满的，而阻断部位以后的各水管中水均流光(见图6-5，B)。

图6-5　有氧氧化稳定时各种传递体的还原太分数

A.不加抑制剂　B.加入抗霉A阻断

复合物Ⅰ：催化NADH氧化、CoQ还原。

复合物Ⅱ：催化琥珀酸氧化、CoQ还原

复合物Ⅲ：催化Co QH2氧化、Cyt c还原

复合物Ⅳ：催化Cyt c氧化、O2还原

表6-2　使用抗霉素A前后各种递电子体的还原型百分数

	FP	Cyt b	Cyt c+c1	Cty aa3
琥珀酸	40	25	19	4
琥珀酸＋抗霉素A	100	100	0	0

从表中可以看出，FP、Cyt b位于抗霉素A阻断部位之前，Cytc、cl、aa3位于阻断部位之后。用不同的抑制剂作此实验，就可以确定呼吸链中各种传递体的排列顺序。

4.在体外实验中，将线粒体分成各种复合物，检测其各自催化的反应，再将其重组，检测其催化能力。

美国格林(Green)等实验室成功地将呼吸链分离成具有催化活性的四种复合物以及CoQ和Cytc.检测各个复合物的功能发现：

可以看出CoQ在复合物Ⅰ与Ⅲ，Ⅱ与Ⅲ之间传递还原当量，Cyt c在复合物Ⅲ与Ⅳ之间传递还原当量。他们又将这四种复合物1：1：1：1的比例混合，加上CoQ和Cyt c重组，基本上恢复了线粒体原有的催化能力。

借助上述实验方法，呼吸链各组分的排列顺序已基本明确，但仍有些不一致的看法，其中以CoQ至细胞色素C这一部分研究得还很不清楚，对于Fe-S和CoQ的定位和数量也有争议。