三、限制性核酸内切酶的分类

按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情况不同，分为三类：

Ⅰ类限制性核酸内切酶　由3种不同亚基构成，兼具有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，去随机切断在识别位点以外的DNA序列，通常在识别位点周围400-700bp。这类酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。

Ⅱ类限制性核酸内切酶 与Ⅰ类酶相似，是多亚蛋白质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别序列周围25-30bp范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要ATP供给能量。

Ⅲ类限制性核酸内切酶　只由一条肽链构成，仅需Mg2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切断DNA。是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言。

表20-1 DNA重组技术中最常用的工具酶

酶	主要用途
限制性核酸内切酶	识别DNA特定序列，切断DNA链
DNA聚合酶Ⅰ或其大片段（Klenow）	①缺口平移制作标记DNA探针 ②合成cDNA的第二链 ③填补双链DNA3’凹端 ④DNA序列分析
耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等）	聚合酶链反应（PCR）
DNA连接酶	连接两个DNA分子或片段
多核苷酸激酶	催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端标记探针
末端转移酶	在3’末端加入同质多聚物尾
SI核酸酶，绿豆核酸酶	降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变为平端
DNA端酶Ⅰ	降解DNA，在双链DNA上产生随机切口
RNA酶A	降解除RNA
磷酸酶	切除核酸末端磷酸基